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精子分析中基于CASA技術(shù)的應(yīng)用指南（二）
三、儀器的基本使用方法
9、當(dāng)儀器用于精漿中非獲能精子運(yùn)動(dòng)分析時(shí)，CASA儀器的放大倍數(shù)的選擇應(yīng)遵循讓大多數(shù)精子離開視野前跟蹤錄像0.5秒。因此對(duì)于人類精子分析，視野范圍不少于200X200 um,這允許被跟蹤精子直線速率平均值可以到達(dá)100um/s。
10、對(duì)于人類精子分析，物鏡放大倍數(shù)是10倍、必須用上合適的孔徑數(shù)值和提供足夠聚光深度。
11、在活力分析中，數(shù)字化設(shè)備應(yīng)有符合標(biāo)準(zhǔn)視頻技術(shù)的最大分辨率。
12、在理想狀況下，人類精子活力分析需要采集圖像的頻率為每秒50幀以上。
13、最少需要跟蹤0.5秒是為了獲取跟蹤軌跡可靠的運(yùn)動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)值。CASA的參數(shù)值應(yīng)為了盡可能隨時(shí)達(dá)到這個(gè)目的而設(shè)置。如果一份樣本中的數(shù)據(jù)包括很大比例的短軌跡，那么用戶必須意識(shí)到這可能是他們對(duì)數(shù)據(jù)和結(jié)果的偏見造成的。如果使用更長(zhǎng)的軌跡，必須通過排除快速運(yùn)動(dòng)離開視野范圍的精子，通過排除額外快速運(yùn)動(dòng)進(jìn)入視野采集窗口中的精子或者計(jì)數(shù)個(gè)體軌跡的分段作為多個(gè)軌跡的精子，且須說明排除后并不影響結(jié)果。
四、測(cè)定精子濃度
14、這不能成為獲取CASA設(shè)備的基本原因。
15、如果用戶希望用CASA儀器測(cè)量精子的濃度，那么他必須使預(yù)期的測(cè)量程序和已經(jīng)存在且可靠的技術(shù)對(duì)比分析來提供準(zhǔn)確的結(jié)果。
16、普遍認(rèn)為現(xiàn)在這一代CASA儀器對(duì)于精子濃度的測(cè)量不能提供準(zhǔn)確、可重復(fù)測(cè)量的值，除非能夠通過特殊的染色方法從其他細(xì)胞和碎片中分辨出精子來。如定量的DNA熒光染色來測(cè)定原子核大小。
五、精子活動(dòng)率的測(cè)量
17、這不能成為獲取CASA設(shè)備的基本原因。
18、如果用于精液常規(guī)分析中，CASA應(yīng)當(dāng)確定逐漸運(yùn)動(dòng)精子的濃度。如果在精液樣本的制備、儀器的使用、用戶適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的定義中足夠謹(jǐn)慎，CASA就能準(zhǔn)確測(cè)量這個(gè)值。
不能依賴CASA儀器在跟蹤活精子的同時(shí)區(qū)分細(xì)胞碎片和死精子，因此現(xiàn)在的CASA儀器不應(yīng)用于精子存活率測(cè)定。
六、精子運(yùn)動(dòng)的測(cè)定
19、目前大家一致同意以下觀點(diǎn)：(ⅰ)測(cè)量的精液樣本濃度高于CASA儀器制造商推薦的濃度一定要用自身無細(xì)胞精漿稀釋；(ⅱ) 所有的CASA分析在體溫環(huán)境下進(jìn)行，人類精子分析在37°C進(jìn)行；(ⅲ) 一定要使用最小深度為10 um的計(jì)數(shù)板，深度大于20 um沒有任何好處。(ⅳ) 每份精液樣本至少分析200條活動(dòng)的精子。
20、研究應(yīng)承擔(dān)發(fā)展出精漿中分離出的精子在人工培養(yǎng)基中精子運(yùn)動(dòng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)的責(zé)任，以達(dá)到活動(dòng)精子的濃度可以調(diào)整到CASA設(shè)備發(fā)揮最佳性能的目的。使用的培養(yǎng)基必須是非獲能的。
21、因?yàn)橥茖?dǎo)非獲能精子平均路徑依賴于圖像采集的幀率和單個(gè)精子的幾何軌跡，所以強(qiáng)烈呼吁CASA設(shè)備制造商開發(fā)允許適當(dāng)?shù)钠交幚砻總€(gè)精子運(yùn)動(dòng)軌跡的軟件。
22、無論是在精漿中還是在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)培養(yǎng)基中，同一類精子運(yùn)動(dòng)學(xué)平均數(shù)值被認(rèn)為價(jià)值有限。這是因?yàn)橹低ǔ２皇钦龖B(tài)分布，使樣本平均值不能準(zhǔn)確估計(jì)樣本。因此(ⅰ) 中位數(shù)、范圍或者百分位數(shù)都被認(rèn)為比平均值更有意義。(ii) 應(yīng)該做出多參數(shù)運(yùn)動(dòng)學(xué)定義。定義將允許將每個(gè)精子按照相關(guān)功能分界端點(diǎn)分為不同的種類（例如穿透力強(qiáng)的精子）。
對(duì)于臨界值的分析，建議每個(gè)軌跡數(shù)據(jù)值保存在數(shù)據(jù)庫(kù)中。無論從樣本描述或和其他樣本對(duì)比時(shí)選擇最合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以便檢查它們的分布情況。
23、強(qiáng)烈呼吁CASA的設(shè)備制造商發(fā)展更加智能重建軌跡的軟件。特別是矢量跟蹤解決令人困惑的軌跡，例如那些相互碰撞精子產(chǎn)生的軌跡，離開視野/進(jìn)入視野錯(cuò)誤結(jié)合在一起的復(fù)合型軌跡。雖然不可能消除對(duì)儀器的依賴，但這將在一定程度上減少檢測(cè)濃度時(shí)對(duì)CASA儀器的依賴。
七、CASA分析超活化精子
24、在識(shí)別超活化精子中平均時(shí)間運(yùn)動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量要特別小心。本文建議現(xiàn)代化的研究應(yīng)專注于無維度的、獨(dú)立機(jī)器的運(yùn)動(dòng)測(cè)量模型。
25、精子超活化研究準(zhǔn)備液化的精液樣本不應(yīng)使用對(duì)精子功能有潛在危害的技術(shù)，例如最初從精漿中分離精子的離心法。
26、應(yīng)采用一種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，即它支持精子體外獲能。然而培養(yǎng)基必須含有至少25 mM 碳酸氫根離子和一定數(shù)量的鈣離子，還有葡萄糖。足夠的蛋白質(zhì)，至少需要10 mg/ml，要包含出現(xiàn)吸附玻璃現(xiàn)象的最小含量。
需要牢記的是含鐵元素的介質(zhì)在人類精子擴(kuò)散培養(yǎng)中已被證明能促進(jìn)形成活性氧（ROS）。
27、所有超活化分析必須在體溫的環(huán)境中進(jìn)行，如人類精子超活化分析在37°C。
28、一定要準(zhǔn)備足夠深度的計(jì)數(shù)板以保證不限制超活化精子的運(yùn)動(dòng)。對(duì)人類超活化精子分析，最小的計(jì)數(shù)板深度為30 um是必要的。盡管50 um也許是理想的深度，它只能在所選用光學(xué)系統(tǒng)解決這個(gè)深度聚焦問題后才能使用。
29、對(duì)于超活化運(yùn)動(dòng)的定義必須把圖像采集頻率考慮在內(nèi)，并且使用已經(jīng)被CASA儀器驗(yàn)證的運(yùn)動(dòng)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。
30、本文建議應(yīng)發(fā)展與機(jī)器無關(guān)的精子運(yùn)動(dòng)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)：(ⅰ) 允許在CASA儀器和實(shí)驗(yàn)室之間更加容易對(duì)比分析。(ii) 把正常無超活化的模型和少見大量超活化模型之間的差異考慮在內(nèi)
八、CASA形態(tài)學(xué)分析
31、現(xiàn)在這一代的CASA儀器沒有足夠的能力用特定方式分析人類精子形態(tài)學(xué)來滿足常規(guī)臨床應(yīng)用。特別是，不能評(píng)估精子的中段和尾部區(qū)域（WHO指南中需要）被認(rèn)為是主要的缺點(diǎn)。因此，在1992年出版的WHO版本中不支持CASA儀器在臨床中評(píng)估人類精子形態(tài)。
32、在準(zhǔn)備人類精子形態(tài)學(xué)分析中（包括制作和染色準(zhǔn)備）應(yīng)該發(fā)展一個(gè)優(yōu)先使用CASA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議。
九、CASA的臨床應(yīng)用
33、在男性不育診斷中，要使用CASA首先應(yīng)對(duì)病人進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐R床評(píng)估（包括臨床病史和身體檢查）。
34、目前，CASA應(yīng)用于臨床應(yīng)首先有根據(jù)公認(rèn)的WHO的指導(dǎo)原則建立的一個(gè)精子的基本概述。
35、臨床醫(yī)生應(yīng)明白分析之前正確處理樣本是獲得有用信息的關(guān)鍵。這對(duì)所有的精液分析都很重要，不僅僅是CASA。因此禁欲時(shí)間和射精到檢測(cè)時(shí)間間隔必須精確記錄。
36、研究是必要的，用目前這一代的CASA系統(tǒng)解釋：(ⅰ) 限制男性正常生育的精液質(zhì)量；(ii) CASA變量和妊娠時(shí)間之間的關(guān)系；(ⅲ) CASA變量（尤其是超活化）和IVF結(jié)果之間的關(guān)系。
WHO5標(biāo)準(zhǔn)特點(diǎn)
十、CASA的生殖毒理學(xué)應(yīng)用
37、在附睪和輸精管的精子毒理學(xué)研究中，接受樣本必須被稀釋，其用戶必須解釋: (ⅰ) 稀釋過程不能損傷精子；(ii)在分析過程中培養(yǎng)基用來支持精子持續(xù)正常運(yùn)動(dòng)；(ⅲ) )精子的濃度已經(jīng)調(diào)整和控制到盡量減少擁擠產(chǎn)生假現(xiàn)象的濃度范圍內(nèi)。
38、顯微鏡放大倍數(shù)根據(jù)精子大小和速度來調(diào)整（對(duì)于比人類精子更大更快的大鼠精子，X4的物鏡是最合適的），并且計(jì)數(shù)板的深度要允許精子無阻力的運(yùn)動(dòng)（計(jì)數(shù)板的深度大于40 um適合大鼠精子）。
39、用戶必須驗(yàn)證儀器設(shè)置已經(jīng)優(yōu)化到能檢測(cè)所有運(yùn)動(dòng)的精子。
40、用戶必須驗(yàn)證圖像采集在檢測(cè)物種的體溫環(huán)境下進(jìn)行。
41、在制備嚙齒類動(dòng)物精液樣本時(shí)，CASA可以用來確定精子運(yùn)動(dòng)百分比和緩慢運(yùn)動(dòng)的百分比。用戶定義的閾值應(yīng)根據(jù)控制樣本中臨界端點(diǎn)的分布來調(diào)整。
42、推薦使用永久保存樣本的方法，例如視頻或數(shù)碼圖片，這樣數(shù)據(jù)在任何時(shí)候都可以重新核查,且當(dāng)軟件功能升級(jí)時(shí)有必要重新檢測(cè)。視野應(yīng)采取隨機(jī)記錄的方式以防止用戶根據(jù)視頻表現(xiàn)來選擇或拒絕特定的視野。
43、新的用戶應(yīng)把它們的樣本制備方法和得出的速率數(shù)據(jù)去與符合當(dāng)前實(shí)踐的文獻(xiàn)中達(dá)到的最低標(biāo)準(zhǔn)做對(duì)比分析。